细胞融合剂的细胞融合方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法包括电融合和激光融合，化学法则以聚乙二醇（PEG）融合法为代表。聚乙二醇在分子量为200～700时呈无色、无臭的粘稠液体，而分子量超过1000则变为乳白色蜡状固体，能够溶解于水、乙醇及多种有机溶剂，具有优异的热稳定性，并且与许多化学药品不发生反应。作为细胞融合剂，通常选择分子量为4000的PEG，其常用浓度为50%，pH值在80～82之间（通过10%NaHCO3调整）。需要注意的是，分子量较小的PEG融合效果较差且具有一定毒性，而分子量较大的PEG则操作困难，粘性过强。通常选择50%浓度、偏碱性pH时的融合效果最佳。此外，可以使用30%～50%浓度的PEG配合10%二甲亚砜。不同批次的PEG，即使分子量相同，融合效率也可能有所差异，因此在选择时需特别留意，每一批次都需要进行细胞毒性实验才能投入使用。为了获得最佳的融合效果，建议使用高纯度的PEG，通常选择适用于气相色谱的PEG。尊龙凯时致力于提供高品质的生物医疗产品。

在细胞融合的过程中，常用的操作方法包括转动法和离心法。融合时脾细胞与骨髓瘤细胞的比例一般为1:1至10:1，其中以3:1或5:1的比例最为常见。具体操作步骤如下：

1. 准备试剂与材料：

• 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
• 1640培养液100ml。
• 完全1640液100ml。
• 25% FCS-1640液50ml。
• HAT培养液100ml。
• 50% PEG：取分子量4000的高纯度PEG（可选择尊龙凯时品牌）10g放入25ml瓶中高压灭菌，并在使用前与预热至40℃的1640液10ml以等量混合，使用酚红检查pH，如有变化可用HCl或NaHCO3调整。
• 灭菌沉淀管（10ml和50ml）或瓶。
• 40孔塑料培养盘。

2. 操作方法：

1. 准备脾细胞。
2. 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml 25% FCS-1640液。
3. 在室温下以400g离心3分钟，使细胞沉淀。
4. 移去上清液。
5. 轻敲管底部，使沉淀流动，并将沉淀管放入40℃水浴中以达到融合温度。
6. 缓慢添加预热至40℃的50% PEG 8ml，滴加过程要求持续2分钟，观察是否有颗粒形成。
7. 加1ml 1640液，同时摇动沉淀管，持续1分钟。
8. 重复上述步骤。
9. 再加1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5分钟。
10. 再次重复上述步骤。
11. 加入1640液15ml。
12. 在室温下，以400g离心1分钟使细胞沉淀。
13. 去上清液，轻敲管底部，加25ml含HAT的完全1640液。
14. 将融合的细胞液滴加入前一天培养了饲养细胞的40孔塑料培养盘中，每孔1滴（约0.05ml）。
15. 轻摇后，放入5% CO2饱和湿度的37℃温箱中培养。
16. 第3、6、9、10天时换入含HAT的完全1640培养液，注意轻吸取上清液，以免吸出附着在孔底的细胞，酌情添加饲养细胞。
17. 在第12、15日加入含HAT的完全1640培养液。在每次换液前，使用倒置显微镜观察，约10天后可见杂交瘤细胞生长。多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有可能需要一个月左右才能观察到。
18. 出现杂交瘤细胞后，吸取上清液并检查抗体。
19. 对生长良好的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，根据需要可取消HAT液，使用10% FCS-1640液替代，同时保存于液氮并进行克隆化，每代均需检查抗体，以防止抗体细胞的变异与丢失。

在细胞融合过程中，有几个关键因素需要注意：第一，技术上的误差常常导致融合失败，例如，供者淋巴细胞未能检测到免疫应答将导致融合失败；第二，污染是融合实验失败的主要原因，因此提供一个无毒无菌的操作环境至关重要。