细胞冻存是保存细胞的重要方法，旨在低温条件下维持细胞的活性和功能。这一技术在生物医学领域中具有重要的应用价值，如细胞系的长期保存、实验重复性、基因库建设以及细胞治疗的储备等。通过冻存，可以减少细胞在传代过程中的遗传变异，降低因污染、环境变化或实验操作失误而导致的细胞损失。最佳的冷冻保存时机是细胞处于最佳生长状态时。

  冷冻保护剂在细胞冻存中至关重要，常用的保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要作用是降低溶液的冰点，减少冰晶的形成，以保护细胞免受冰晶的机械损伤。虽然DMSO适用于大多数细胞类型，但对于某些对其敏感的细胞，可以考虑使用甘油作为替代。

第1阶段：冷冻保存实验步骤

  1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型，以及其他有用信息（如基因改造）。
  2. 对于贴壁细胞，先移走细胞培养基，用PBS清洗，添加适量胰蛋白酶覆盖细胞并在37°C培养箱中孵育约2分钟（孵育时间应根据实际细胞类型调整）。然后，加入等量培养基终止消化，并用移液枪轻轻吹打细胞，将其转移到50mL Falcon管中。
  3. 对于悬浮细胞，直接将所需体积细胞转移至50mL Falcon管中。
  4. 使用血细胞计数器计数细胞，以确认活力。冷冻保存的细胞活力应至少为75%。
  5. 以300×g的速度在室温下离心5分钟。
  6. 准备冷冻培养基（见表1）。

表1 不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方

  - 绝对培养基中含有FBS的细胞：90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜
  - 无血清培养基中培养的细胞：90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜
  - 需要甘油冷冻的细胞：90%胎牛血清 + 10%甘油

  使用前将培养基混合均匀并加热至37°C。冷冻培养基中含有必要的冷冻保护剂，如DMSO等，以防止对细胞膜和成分造成损害的冰晶形成。请注意，DMSO并不适合所有细胞类型，有时可使用甘油替代。

  7. 除去上清液。
  8. 加入冷冻培养基至所需细胞密度，通常为1×10⁶/mL，冻存液中的细胞在室温下放置的时间不应超过10分钟。
  9. 将1mL样品分装到冷冻管中，并盖紧。
  10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，再放入-80°C冰箱。冷冻盒外周添加适量异丙醇，确保温度以每分钟1°C的速度稳定下降。缓慢冷冻有助于防止细胞内冰晶形成。
  11. 约24小时后，将冷冻管取出并转移至液氮中进行长期储存。通常冷冻细胞可以在液氮中保存数年，理想情况下，冷冻细胞不应在-80°C下保存超过一周，并应尽快转移至液氮，以免影响细胞活力。

第2阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

  1. 从液氮储存器中取出冷冻管，快速放入37°C水浴中，解冻至约80%，此过程不应超过1分钟。缓慢的解冻会对细胞造成损害，因此应尽快解冻，同时DMSO也具有一定的细胞毒性，因此应加速解冻，以便快速稀释和去除DMSO。
  2. 使用移液器将冷冻管中的物质转移至含约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。
  3. 以300×g离心5分钟，弃上清液，用适量培养基重悬细胞沉淀。
  4. 将细胞悬液转移至培养容器中，并在37°C培养箱中继续培养。

  在细胞冻存与解冻过程中，使用尊龙凯时的试剂与设备无疑能帮助科研人员提高细胞活力与实验重复性，为生物医学研究铺平道路。