在进行磷酸化蛋白Western Blot (WB) 分析时，我们常常面临条带弱、背景高以及结果不确定等诸多挑战，这些困扰着每一位研究者。磷酸化蛋白WB被称为实验室的“噩梦”，其根本原因在于磷酸化蛋白的丰度低、动态变化大及易降解等特点。任何一步操作的失误，都可能导致信号的丢失或非特异性信号的放大。今天，Dr. Connie将深入分析磷酸化蛋白WB实验中存在的痛点，并分享一些切实可行的改进建议。

磷酸化蛋白WB的痛点与解决方案

样本制备

1. 占比小：磷酸化蛋白通常只占总蛋白的1%-10%，因此需要检测的信号往往接近WB的检测下限。

2. 动态范围窄：酶活性变化可导致磷酸化水平在几分钟内波动。以EGF刺激EGFR的磷酸化为例，其在5分钟内达到高峰，30分钟后恢复基线，容易错失真实信号。

3. 磷酸酶的持续作用：细胞裂解后释放的内源性磷酸酶会迅速催化磷酸化蛋白去磷酸化，导致磷酸化水平的衰减。

4. 温度敏感：在室温下，磷酸化蛋白的半衰期仅为数分钟。例如，MAPK磷酸化在25℃下10分钟内降解90%。

综上所述，成功进行磷酸化蛋白WB的关键在于样品的质量。因此，样品制备环节尤为重要！确保在整个蛋白提取过程中都保持冰浴，避免高温引起的降解；在蛋白裂解液中加入适量的磷酸酶和蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解或去磷酸化；尽量使用新鲜的蛋白样本，并在液氮中快速冷冻，-80℃分装保存，避免反复冻融；在电泳时，确保足够的蛋白上样量。

抗体选择

1. 查阅相关文献，确认目标蛋白的磷酸化位点，并选用已验证的磷酸化抗体。使用高效的磷酸化抗体有助于提高信号的灵敏度（不同批次的抗体可能存在灵敏度差异，建议在同类型实验中使用同一批次抗体）。

2. 总蛋白的表达量可以作为另一种内参，以便区分磷酸化蛋白的表达变化与总蛋白表达量的变化。因此，除了常用的GAPDH或β-actin内参外，建议同步检测总蛋白的表达水平。

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电泳及转膜

1. 根据目标蛋白的大小选择合适的凝胶浓度，整个电泳过程保持冰浴，避免因温度过高导致磷酸化降解。

2. 磷酸化蛋白WB中可能会出现非特异性条带，使用合适的蛋白Marker来确认目标蛋白的大小，避免错误结果。

3. 使用新鲜配置的转膜液可提高转膜效率。

4. PVDF膜比NC膜更有效地捕集磷酸化蛋白，更适合此类转移。

5. 对于小分子磷酸化蛋白，转膜效率可能较低，可尝试缩短转膜时间或降低转膜电压。

封闭及抗体孵育

1. 封闭时推荐使用5%BSA，效果可能优于5%脱脂奶粉（部分实验者发现脱脂奶粉会导致高背景和条带模糊等问题，可能是由于部分奶粉中的磷蛋白影响所致，具体操作可根据实验情况进行优化）。室温封闭1小时即可，不宜过长。

2. 抗体孵育：根据抗体说明书或文献中提供的稀释比例进行抗体稀释，建议使用4℃过夜孵育。根据实际实验结果优化抗体的孵育时间和浓度。

每个环节的细节都可能影响磷酸化蛋白WB实验的最终结果，因此务必关注样品的磷酸化状态，并根据实际情况不断优化实验条件，以确保最终结果的准确性与可重复性。

此外，尊龙凯时可为客户提供一系列高特异性、高灵敏度的磷酸化抗体，适用于WB、IHC等多种应用。以下是部分磷酸化抗体目录：

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• 货号 RHJ88704 - Anti-Phospho-RIPK3(pS199) Antibody
• 货号 RMD96501 - Anti-Phospho-AKT1(pS473) Antibody
• 货号 RHF62702 - Anti-Phospho-HistoneH3(pT11) Antibody
• 货号 RHJ88701 - Anti-Phospho-RIP3(pS227) Antibody
• 货号 RHC82407 - Anti-Phospho-Tau(pS396/pS404) Antibody
• 货号 RHH20001 - Anti-Phospho-Smad2(pT8) Antibody